人颗粒溶素(GNLY)ELISA试剂盒

人颗粒溶素(GNLY)ELISA试剂盒
简介
颗粒溶素（GNLY）是一种在大多数哺乳动物中表达的蛋白质，其功能是由杀伤性淋巴细胞在细胞毒性颗粒中释放的抗菌肽。它是一种成孔肽，因为它可以刺穿微生物细胞壁，使其他诱导死亡的酶进入微生物并引起微ptosis。它是皂素样蛋白家族的一部分，其基因在人类的第2条染色体上发现。它的特点是具有5个α螺旋结构。它的表达仅限于细胞毒性免疫细胞，如细胞毒性T细胞、NK细胞、NKT细胞和γδT细胞。颗粒溶素具有5个α螺旋结构，属于类沙普生蛋白家族。它以两种形式表达：一种是15kDa前体蛋白，另一种是9kDa细胞毒蛋白，它是由15kDa蛋白的氨基和羰基端裂解后形成。
检测原理
本试剂盒采用双抗体夹心法ELISA技术 : 将捕获抗体包被于酶标板上，捕获样品及标准品中的待测物GNLY，清洗后，再加入标记的检测抗体进行孵育后清洗，形成“捕获抗体-抗原-检测抗体"免疫复合物，随后加入链霉亲和素偶联的辣根过氧化物酶进行孵育，待孵育结束后清洗，接着加入TMB显色后，若样本中有待测物则显蓝色，加入终止液停止反应。检测过程中游离的成分均被洗去，用酶标仪在450 nm处测OD值，颜色的深浅和样品中的待测物的含量呈正比，通过绘制标准曲线计算出样本GNLY的浓度。
需要的其他材料
1. 酶标仪，包含450nm测定波长，同时包含600-680nm校正波长更佳；
2. 移液器及枪头；
3. 蒸馏水或去离子水；
4. 100-1000 mL刻度量筒；
5. 洗瓶、排枪或自动微孔板清洗机；
6. 水平轨道微孔板振荡器，能够保持500±50 rpm的速度；
7. 用于稀释标准品和样品的试管。
样品保存
样品收集后若在 1 周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或-80℃（6个月内检测），避免反复冻融，标本溶血会影响检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。
试剂准备工作
使用前将所有试剂置于室温平衡30分钟左右。
洗涤液/稀释液配置
如果洗涤液/稀释液（20×）有晶体析出，需在37℃下加热⾄晶体全部溶解。用蒸馏水1:20稀释（例如：1mL 浓缩洗涤液加入19mL的蒸馏水）
标准品配置
试剂盒中取出标准品，准备7个试管，先从500ng/mL标准品（200μL）按需吸取一定量用1×稀释液稀释至25ng/mL（例：50μL的标准品母液+950μL的1×稀释液，制备得到1000μL的25ng/mL浓度标准品），随后在6个试管中分别加入500μL的1×稀释液，在这6个单独的试管中将25ng/mL标准品依次2倍倍比稀释至6个梯度，共配制7个浓度的标准品，依次为:  25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.563ng/mL、0.781ng/mL、0.391ng/mL，从最高浓度标准品溶液中吸取500μL标准品到下一个试管中，轻轻吹打混匀，以此类推进行标准品的倍比稀释（如图所示），1×稀释液用作零浓度标准品(0ng/mL)。

抗体工作液配置
使用十分钟前，将100×检测化抗体于1000×g离心1分钟，随后用1×稀释液将100×检测化抗体稀释成1×检测化抗体工作液，根据所需用量当日配置当日使用。
酶结合物工作液配置
使用十分钟前，将100×SA-HRP溶液于1000×g离心1分钟，随后用1×稀释液将100×SA-HRP稀释成1×SA-HRP工作液，根据所需用量配置。

备 注：如待测样本GNLY浓度高于标准品高值，请根据实际情况选择适当的稀释倍数。

人颗粒溶素(GNLY)ELISA试剂盒
结果的计算    

计算标准品和样本复孔的平均OD值并减去空白孔的OD值作为校正值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线(作图时去掉空白组的值)。或者使用能够生成四参数逻辑（4-P）曲线拟合的计算机软件来创建标准曲线。若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。示例数据以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验数据建立标准曲线。

本图所示标准曲线仅供示例，结果计算应以同次试验标准品所绘标准曲线为准计算样本结果。

重复性
板内变异系数小于10%，板间变异系数小于10%。

灵敏度
经样本测试，本试剂盒的检测灵敏度为0.20ng/mL。
特异性

该试剂盒测定可识别重组人GNLY。

其他相关蛋白在稀释缓冲液中制备为50ng/mL，并测定交叉反应性。没有观察到明显的交叉反应。

人颗粒溶素(GNLY)试剂盒仅供科研使用，用于定量检测细胞培养上清、血清、血浆中的人GNLY。