鬼笔毒肽(PLD)ELISA试剂盒

鬼笔毒肽(PLD)ELISA试剂盒

简介
鬼笔毒肽，系从毒蕈类鬼笔鹅膏（Amanita phalloides）中得到的有毒的环状七肽，为细针状结晶。往往与鹅膏毒素（amatoxins）一起存在（它们来自同一条合成途径），毒性比鹅膏蕈碱弱，对小鼠的半致死剂量是50ug/kg，对人体也有很强的毒性，可引起流涎、呕吐、便血、发绀、痉挛、肌肉挛缩，以致死亡。它同细胞松弛素的作用相反,只与聚合的微丝结合，而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后,抑制了微丝的解体，因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。本酶联免疫检测试剂盒可以经济、快速地检测饲料等样品中的鬼笔毒肽的残留量。
检测原理

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中鬼笔毒肽和微孔条上预包被的偶联抗原竞争鬼笔毒肽抗体，加入酶标二抗后，形成包被抗原-抗体-酶标二抗复合物。随后结合的酶催化TMB底物显色，样本吸光值与其含有的鬼笔毒肽成负相关。通过标准曲线可准确定量样品中鬼笔毒肽的含量。通过标准曲线计算所得值乘以样品处理的稀释倍数即为实际样品中鬼笔毒肽的含量。

需要的其他材料
1. 酶标仪，包含450nm测定波长，同时包含600-680nm校正波长更佳；
2. 移液器及枪头；
3. 蒸馏水或去离子水；
4. 100-1000mL刻度量筒；
5. 洗瓶、排枪或自动微孔板清洗机；
6. 水平轨道微孔板振荡器，能够保持500±50 rpm的速度；
7. 用于稀释标准品和样品的试管。
试剂准备
使用前将所有试剂置于室温平衡30分钟左右。
洗涤液/稀释液配置
如果洗涤液/稀释液（20×）有晶体析出，需在37℃下加热⾄晶体全部溶解。用蒸馏水1:20稀释（例如：1mL 浓缩洗涤液加入19mL的蒸馏水）
鬼笔毒肽(PLD)ELISA试剂盒
标准品配置
试剂盒中取出标准品，准备7个试管，先将3000ppb标准品（200µL）按需吸取一定量用1×稀释液稀释至729 ppb（例：243µL的标准品母液+757µL的1×稀释液，制备得到1000μL的729 ppb浓度标准品），随后在6个试管中分别加入600μL的1×稀释液，在这6个单独的试管中将729 ppb标准品依次3倍倍比稀释至7个梯度，共配制7个浓度的标准品，依次为：729ppb、243ppb、81ppb、27ppb、9ppb、3ppb、1ppb，从最高浓度标准品溶液中吸取300μL标准品到下一个试管中，轻轻吹打混匀，以此类推进行标准品的倍比稀释（如图所示），1×稀释液用作零浓度标准品(0ppb)。



一抗工作液配置
使用十分钟前，用1×稀释液将100×一抗工作液稀释成1×一抗工作液，根据所需用量配置。
酶标二抗工作液配置
使用十分钟前，用1×稀释液将100×酶标二抗稀释成1×酶标抗体工作液，根据所需用量配置。

备 注：如样本中待测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况选择适当的稀释倍数
(建议：将待测样本用样品稀释液低稀释1倍，在正式实验之前做预实验，以确定具体稀释倍数) ；标准品母液及100×酶标二抗溶液根据实验所需酶标板孔数吸取一定量配制工作液，剩余溶液应放回-20℃储存，且避免反复冻融。（若实验在1-2周内做完，标准品母液及100×酶标抗体置于2-8℃保存；若实验为长时间跨度实验，建议将标准品母液及100×酶标抗体置于-20℃保存，以保证实验结果的稳定性）

结果的计算

计算标准品和样本复孔的平均OD值并减去空白孔的OD值作为校正值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线(作图时去掉空白组的值)。或者使用能够生成四参数逻辑（4-P）曲线拟合的计算机软件来创建标准曲线。若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测并在计算样本浓度时乘以相应的稀释倍数。

示例数据

以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验数据建立标准曲线。

精密度

批内精密度 ：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在同一个板块内精度评估。

批内变异系数 CV%小于10%。

批间精密度 ：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在不同板块内精度评估。
批间变异系数 CV%小于15%。
回收率
样本回收率：80% - 120%

灵敏度

经样本测试，本试剂盒的检测灵敏度为1 ppb。
线性关系

校准品剂量反应曲线相关系数r值，大于等于0.999。